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對環境友善安全的微生物殺蟲劑—蘇力菌

一、前言

  今年春夏之交,SARS嚴重流行;其後又盛傳台灣發生三十八年來第一個瘧疾本土病例,其實去(2002)年高屏地區爆發流行的登革熱亦甚嚴重,確定病例5336人,其中出血登革熱242病例,死亡21人。疫病流行,各單位緊急噴灑藥劑防治;SARS流行噴灑了許多漂白水,瘧疾、登革熱病媒防治更噴了不少化學殺蟲劑。這些藥劑過度撒布到環境裡,有可能造成一些負面影響。即使是一 向被認為對環境低毒、安全之合成除蟲菊精殺蟲劑-百滅寧,近年來亦被列入環境荷爾蒙名單內。因此環保人士、有識之士,莫不對化學藥劑敬而遠之。

  其實自然界常一物剋一物,各種病菌、病媒亦均有其天敵,吾人可善加篩選、培育作為生物防治之用,微生物殺蟲劑即為一例;最有名的當推蘇力菌(Bacillus thuringiensis,),尤其是其以色列變種(亞種)之用於登革熱病媒幼蟲孑孓防治,曾被廣為推廣。

二、蘇力菌

  科學家從自然界篩選出1,850多種的微生物或其代謝產物供為害蟲防治之用。包括一百多種的細菌、七百種以上的病毒、750種的真菌以及至少三百種的原生動物。但美國環保署僅核准16種供商業化推廣使用。

  細菌類的微生物殺蟲劑,主要多為桿狀的桿菌屬(Bacillus)以及Enterobacteriaceae科、Micrococcaceae科、Pseudomonadaceae科以及Bacillaceae科。約有100種的細菌會為害昆蟲,其中有四種研究較為詳盡徹底,被廣泛用為害蟲防治,即Bacillus thuringiensis、B.popilliae、B.lentimorbus、B.sphaericus。其主要特性為具專一性,寄主範圍狹窄,對非標的生物(人及害蟲天敵)無毒、無害。

  細菌為最早商業化的微生物殺蟲劑。早在1948年一種稱為Doom的乳狀孢子菌,用來防治日本金龜子幼蟲,其內即含有兩種桿菌(Bacillus lentimorbus, B. popilliae),一直延用至今。其次為蘇力菌(Bacillus thuringiensis)kurstaki變種(BTK)用來防治毛毛蟲。其後,又發現許多的蘇力菌品系,並製成各種劑型,以防治各種不同的害蟲。最近更發現有B. sphaericus,亦正開發進行商業化。

  上述四種桿菌,常呈孢子狀態存在於土壤中。孢子為細菌繁殖型,可以忍受一段時間的紫外線照射、耐乾燥、以及其他的惡劣環境。B. thuringiensis. B.popilliae 還可以從芽胞細胞內代謝產生蛋白質結晶。此結晶對害蟲具毒性,為製成微生物殺蟲劑的主要成份。

  蘇力菌為深具商業應用價值之微生物殺蟲劑,可以使多種害蟲致病。此菌早在1911年由德國人Thuringia在地中海粉螟蛾幼蟲發現,並予以命名,現在至少可以鑑定出35種變種,各攻擊不同種的害蟲。其孢子內能產生毒蛋白結晶。

  蘇力菌依美國伊里諾大學昆蟲學家Rick稱:商業上生產蘇力菌,係運用一大型發酵槽發酵,當桿菌在最適環境下分裂增殖,每一細胞內部各產生一個孢子,以及結晶之毒蛋白稱之「內毒素(endotoxin)」。Ozkan等(2000)培養Bti Cry11Aa及Cry4Ba品系以(NH4)2HPO4作為氮源,Bti產量最高。

  一般市售的蘇力菌商業產品多含有孢子及毒蛋白,但也有只具毒蛋白者。各個蘇力菌亞種或變種所產生之「毒蛋白」,其「蛋白內毒素」各異。此種毒蛋白具專一性,使得蘇力菌產品,各有其不同的害蟲防治對象,而不會傷害到其他生物。

  1958年,美國第一個上市的蘇力菌為kurstaki變種,稱之BTK,只能用來防治鱗翅目(蝴蝶、蛾類)的幼蟲。1980年代美國環保署許可數種BTK品系,可以防治鱗翅目以外的害蟲,其中包括以色列變種(B. thuringiensis israelensis, Bti),可以殺死雙翅目某些種蚊子、黑蚋、蕈蚋之幼蟲。

(一) 蘇力菌之性狀:蘇力菌產品呈褐色或單寧色粉末、或橘紅色顆粒,含有孢子、毒蛋白以及一些不活性物 質。蘇力菌製劑,市售產品為能動之菌體,每公克約2.5×1010個孢子;每個細菌寬1 μm,長5 μm。保存期限六個月,不適與鹼性物質混合。 

(二) 蘇力菌之作用機制:蘇力菌為一胃毒劑,必須讓害蟲取食引起消化道中毒而死,所有蘇力菌產品之作用原理,均與此類似。當蘇力菌孢子及其毒蛋白結晶內毒素被標的害蟲取食,進入中腸,中腸內呈高度鹼性,並含有許多酵素,以致於毒蛋白結晶溶解,會使中腸細胞麻痺,毒蛋白成份隨即攻擊害蟲腸壁,阻斷酵素系統,干擾正常的消化作用,腸壁迅即產生破洞、腸穿孔,而使得腸內的物質進入體腔、血淋巴。此一初步中毒,使得害蟲停止進食,甚至於麻痺,然後細菌孢子經由此腸破洞侵入害蟲體腔及其他組織,在血淋巴內繁殖數小時,引起血淋巴中毒、敗血症,迅速將害蟲殺死或數日後死亡。

毛毛蟲如果取食到蘇力菌,可能殘命茍活數日,但中毒之害蟲已無心飲食,所以不會繼續為害。死去之害蟲乾癟成暗色,但仍成90度的吊掛在枝葉上。蘇力菌雖然會在受攻擊之害蟲體內增殖,但幾乎不會再產生孢子或毒蛋白結晶。一般被蘇力菌殺死的害蟲,不會成為新的感染源。因此,與一般殺蟲劑一樣,自然分解消失;如果害蟲孳生源沒有清除,必須多次的施藥。

蘇力菌對於標的害蟲以外的生物(尤其是天敵)無毒害。因此,受蘇力菌寄生之害蟲,更容易被其天敵捕食或寄生,進而降低害蟲之密度,更可減少殺蟲劑之使用。

(三) 劑型:蘇力菌可製成液體濃縮劑、可濕性粉劑、粉劑、粒劑或餅塊劑。

最近有另添加黏著劑,使其易於覆蓋樹葉表面,增加顆粒密度者,當空間噴灑時,減少揮散、增加美味,以誘引害蟲取食,減少陽光曝露之破壞、增加混合效果等。過去認為蘇力菌對某些害蟲防治無效,劑型改良後,都要從新測試。

(四) 蘇力菌之毒性:依據美國USDA之評估報告,蘇力菌之各種毒性如下:

1. 急性毒:人體口服1,000 mg/day無影響;以6.7×1011 孢子高劑量曝露對鳥、狗、天竺鼠、小鼠、大鼠,甚至於人皆無不良反應。對大鼠之LD50在5,000~13,000 mg/kg。兔子皮膚接觸毒LD50為7,200 mg/kg,但會對眼睛有些微刺激,致眼紅流淚,其實這是物理性的刺激而非生物性的作用。對小鼠進行呼吸實驗,以6.0×1010孢子/公升之呼吸量曝露1小時以上,未發現症狀。   2. 慢性毒:8個人曝露在蘇力菌發酵槽、潮溼的菌餅、廢菌液、甚或純的蘇力菌粉,持續7個月無不良感覺。大鼠以8,400 mg/kg/day劑量之蘇力菌餵飼 13週無影響。以1 mg/kg/day劑量塗敷大鼠皮膚傷口21天,僅發現皮膚發紅,但無任何症狀。

3. 生殖毒:無

4. 突變影響:蘇力菌會使部分植物受傷組織病變,但對取食之哺乳動物無影響。

5. 致癌性:蘇力菌以8,400 mg/kg/day高劑量飼養大鼠兩年,無致癌性。

6. 生態影響:對鳥之LD50超過10,000 mg/kg。蘇力菌噴灑區域,觀察野外74種鳥類,未發現族群有何變化。

7. 對水生物之影響:蘇力菌對魚類實際上無毒。將?魚曝露於560~1,000 mg/L水溶液中96小時,無任何影響,但小蝦(shrimp)、貽貝(mussel)則略有影響。

8. 對其他動物之影響:蘇力菌對大部份有益昆虫無毒無害,對蜜蜂及其生產之蜂蜜無毒害,蜜蜂以每c.c.含有108 個孢子之高劑量蘇力菌糖漿餵飼,並無症狀。此外,蘇力菌對兩棲類之青蛙、爬虫類之蜥蜴均無不良影響。

9. 蘇力菌在環境中之宿命:

    (1)

    在土壤及地下水中,蘇力菌為某些害蟲之天然病原菌,但釋入環境中極易於被破壞分解,由於其 生物半生週期(biological halflife)很短,且具專一性,所以不會如同化學殺蟲劑一般的對標的害蟲以外的動物造成傷害,標的害蟲也不會對其產生抗藥性。蘇力菌在良好土壤環境中之自然半生期雖為四個月,但當被蘇力菌殺死之害蟲,蘇力菌由蟲屍釋入泥土中,土壤中的pH值在5.1以下,蘇力菌隨即失卻其活性。微生物殺蟲劑在土壤中不移動,也不會被地下水溶滲,不會影響到地下水。

    (2) 在水中之分解:美國環保署並未限制蘇力菌在水體中之使用,足見其安全無慮。蘇力菌在水中可以存活48小時以上,其後逐漸沉澱、安定或黏附於懸浮之有機物上。

    (3) 蘇力菌在植物上之分解:由於陽光紫外線的照射破壞,蘇力菌在植物上快速分解;在正常陽光下,其半生期3.8小時。對植物無毒,不影響其開花,結果或種子發育。

(五) 安全性:蘇力菌於1961年美國核准為一般用殺蟲劑(General use Pesticide,GUP),因其對眼睛皮膚可能有些微刺激作用,故其毒性分類屬第三類-微毒。蘇力菌一般認為對人無害,技術級之純蘇力菌,對老鼠的口服半數致死量LD50為400 mg/kg,但製成劑型,濃度降低則為8,100 mg/kg。通過人體口服毒性試驗,故美國藥物食品檢驗局核准「免於食物殘留量試驗」,蘇力菌可以直接用於食用作物。意即蘇力菌對供試動物,實質上無毒,直接施用於食用作物,對人體無害。在實驗室有一案件,實驗人員不小心將蘇力菌溶液濺入眼睛,結果並無症狀影響,只是產生一些抗體。當蘇力菌孢子吸入呼吸道或擦到皮膚破皮處,身體反應,主要是一些「外來蛋白質」,對於體質比較敏感的個體會造成過敏現象。噴灑蘇力菌施工,只要按一般的個人防護,戴手套、口罩、穿長袖、長褲即可。  (六) 應用:蘇力菌為蘇力桿菌之無性生殖細胞-孢子,所產生之毒蛋白結晶體,當此孢子被害蟲幼蟲取食後會對標的害蟲殺害,故其為胃毒劑。蘇力菌之防治害蟲一定要被生長發育期之幼蟲取食,才能發揮藥效,蘇力菌對成蟲則無防治效果。由於蘇力菌為一活的微生物,因此,儲存時要避免高溫。理想的話,蘇力菌在使用以前應儲存於冷藏室。儲存於低溫多少可以延長其效期,在21℃至24℃,蘇力菌粉能保存2~3年有效。運輸時要注意陰涼和通風,不要直接曝露於陽光下,在熱天不要裝於密閉的卡車內。 由於儲存的溫度會影響到蘇力菌產品的效力及生存活力,所以購買蘇 力菌時,要送貨者認定是新鮮貨品。有些零售送貨者,以凋萎之蘇力菌(在高溫或其他不良環境下儲存,其效價明顯降低)供貨,吾人可檢視包裝上的製造日期,批號作為研判參考。大部份的蘇力菌劑型,以水稀釋噴洒,如為可濕性粉劑加水稀釋時,要一邊添藥,一邊攪拌。稀釋用水,酸鹼度最好是pH:7或略低,使呈弱酸性。如為pH:8之鹼性,將會破壞蘇力菌毒蛋白之結晶,而影響其藥效。幸好,許多產品有緩衝效應,可以減少pH值之不當。藥劑現用現泡,稀釋後12~72小時,將失去其藥效。

  由於儲存的溫度會影響到蘇力菌產品的效力及生存活力,所以購買蘇 力菌時,要送貨者認定是新鮮貨品。有些零售送貨者,以凋萎之蘇力菌(在高溫或其他不良環境下儲存,其效價明顯降低)供貨,吾人可檢視包裝上的製造日期,批號作為研判參考。大部份的蘇力菌劑型,以水稀釋噴洒,如為可濕性粉劑加水稀釋時,要一邊添藥,一邊攪拌。稀釋用水,酸鹼度最好是pH:7或略低,使呈弱酸性。如為pH:8之鹼性,將會破壞蘇力菌毒蛋白之結晶,而影響其藥效。幸好,許多產品有緩衝效應,可以減少pH值之不當。藥劑現用現泡,稀釋後12~72小時,將失去其藥效。

三、蘇力菌以色列變種(B. thuringiensis israelensis, Bti)

  蘇力菌以色列變種最早是由Goldberg與Margalit在1977年,首先自土壤中篩選分離出來,用於蚊蟲幼蟲之防治。蘇力菌過去一般咸認為僅對防治鱗翅目害蟲有效,此後則開創出另一新的市場;1980年代以後,蘇力菌以色列變種迅即為美國各州普遍用為蚊蟲防治。WHO則在非洲推廣用於血絲蟲病媒蚊之防治,但Bti對鱗翅目幼蟲則無效。在免疫學上,Bti毒蛋白結晶含有較其他蘇力菌為多的lysine, threonine, proline, valine, methionine, isoleucine 且含有sugars glucose, mannose, fucose, rhamnose, xylose, galactosamine等成分。

(一) 蘇力菌以色列變種之註冊:Bti係從自然界土壤中篩選出來的桿菌,美國環保署於1983年核准使用於蚊蟲防治。蚊子幼蟲孑孓取食Bti產品(含有活性孢子及毒蛋白結晶)後,毒蛋白結晶之分子會與孑孓中腸細胞的受體鍵結,而破壞其消化道。但此毒蛋白結晶不與哺乳動物(包括人)腸細胞受體鍵結,具高度專一性,故對人畜甚為安全。迄2002年美國EPA已核准26種Bti產品上市。美國EPA在Bti微生物製劑核准前,經歷過無數次的實驗,証實對人體無毒,只要依照標示使用,對人類健康無害,對野生動物,非標的種類,甚或環境均無礙。 

(二) 蘇力菌以色列變種之防治對象害蟲:Bti產品用以防治幼蚊孑孓、黑蚋及蕈蚋幼蟲最為有效。Bti對斑蚊屬(Aedes)、Psorophora屬之幼蚊感受性最佳,如用來防治瘧蚊屬(Anopheles),家蚊屬(culex)則需要的劑量要提高。Bti如用來防治蠅類,只適用於黑蚋之水生幼蟲、蕈蚋之Megaselia屬、Lycoriella屬。Bti對普通家蠅、刺蠅則無效。此可能由於這些蠅類的幼蟲蠅蛆(maggot)孳生於水肥等動物排泄物或高有機質內,而Bti的孢子在此環境之下,迅速分解所致。Bti桿菌經由孑孓取食侵入蟲體,殺死孑孓相當安全,且因其高度的選擇性,只殺死孑孓及某些種水生昆蟲,對環境相當友善。Bti最常施用於幼蚊孑孓孳生之積水處,例如水溝、池塘、水庫、儲水容器、花瓶、水盤、廢容器等之積水處、鹽澤、水田以及黑蚋幼蟲孳生之小溪。水生昆蟲蜉蝣、石蠶、豆娘、蛇蜻蛉、蜻蜓等之稚蟲不會去取食Bti之蛋白結晶,且均不具感受性;而蜻蜓之成蟲、稚蟲均會捕食Bti中毒之孑孓或成蚊,但不具為害性。

(三) Bti如何防治蚊子幼蟲:Bti與其他蘇力菌品系一樣,具胃毒作用,當孑孓吃到孢子,可以破壞蚊子幼蟲中腸之細胞(如圖),其殺蟲作用迅速,用以防治家蚊15分鐘後,棲群半數致死,其餘的亦在一小時內死亡,甚至於有的個體於曝露5分鐘內死亡。Ponce等(2002)在墨西哥試驗以Bti取代temephos防治埃及斑蚊幼蟲,其曝露24小時LC50為0.0104 ppm. LC95為0.18 ppm。Dominic等(2000)以Bti之懸浮劑處理熱帶家蚊,其LC50為0.046 mg/L,以1.2 l/ha之劑量2~8天可以達到80 ﹪之防治率。Zaiunin等(2002)利用埃及斑蚊二齡幼蟲孑孓捕食Bti毒蛋白Cry11A及Cry4B,然後以電子顯微鏡超微細觀察孑孓消化道之病理變化,發現中腸之細胞質崩潰瓦解,出現大型之孔隙;微絨毛的數目減少,甚至於被破壞消失殆盡;週圍之滋養膜在中腸管腔內消失。而前腸及後腸的上皮細胞及表皮細胞則無此現象;Cry4B型要優於Cry11A。

(四) Bti之劑型與應用:Bti常與玉米穗軸製成顆粒劑型,用以防治孳生於樹洞,廢輪胎堆裡或其他方法無法到達之孑孓孳生場所。Bti適用於清澈、寧靜的水域,高濁度及高有機質會降低其藥效。Bti市售產品有Teknar. Bactimos. Vectobac 等品牌,為防治孑孓最低毒且高度選擇性之藥劑。

  據Robert等(1998)之報告,Bti 孢子及其毒蛋白結晶,可以崁入幼蚊孑孓之食物-原生動物Tetrahymena pyriformis之液胞內,形成穩定的生物膠囊(bioencapsule)。每一隻T.pyriformis細胞於其食物空胞內濃縮有多數的Bti 孢子及其毒蛋白結晶,當幼蚊孑孓取食此原生動物時,即會順便將Bti 及毒蛋白結晶食入,因而迅速死亡。未被取食的原生動物,其食物空胞內未消化的物質,即被細胞排泄消失。因此,生物膠囊的防治幼蚊孑孓效果,取決於食物空胞內Bti 孢子及毒蛋白結晶之排泄時間。

  Fillinger等(2003)在非洲肯亞以Bti水懸粒劑防治瘧蚊幼蟲,要比粉劑效果顯著。每週施藥一次,足以抑制病媒瘧蚊之再出現。如能與蚊帳泡藥防治成蚊搭配,實施綜合病媒管理(Integrated Pest Management, IPM),其防治成效更加顯著。

  Maldonado等(2002)將Bti製成多隅體粒劑,在20~35℃及50~80﹪相對濕度下儲存一年,然後以埃及斑蚊作藥效試驗,觀察曝露24小時後的死亡率。Bti之LC50與LC90分別為0.016及0.051 mg/L,多隅體劑型儲存8個月,藥效幾乎沒降低。日光紫外線曝露,對照組降低40~46﹪,而實驗組僅稍微有變異。10﹪Bti阿拉伯膠多隅體劑型,施用後14天仍有80﹪之死亡率;動物膠製成者為65﹪死亡率;而以石腊製成者(5﹪)21天有60﹪之死亡率。相對於對照組處理14天後,死亡率僅2.6﹪,市售產品亦僅37﹪。Srivastava(1999)稱Bti之可濕性粉劑,使用後可迅速殺死幼蚊孑孓,但持效僅21天,緩慢釋散劑型則可持效49天之久,製成懸浮錠劑可持效28天。Prabakaran等(2001)將Bti以藻酸?製成膠囊念珠狀(alginate encapsulated beads),施用後Bti飄浮於水面,從第6~27天,平均孢子釋出率3.04×104 ml/day,孑孓死亡率91~100﹪。28~33天,孢子釋出率1.16×104 ml/day,幼蚊死亡率72.2~88.2﹪。34~40天,孢子釋出率4.97×103 ml/day,幼蚊死亡率42.2~67.2﹪。

  Gunasekaran等(2002)以Bti防治污水池及化糞池等高污染積水孳生之熱帶家蚊幼蟲。處理區比對照區慢兩週成蚊開始出現。處理30~34天,成蚊減少80﹪以上,因此建議Bti每個月施放一次。

Ibarra等(2003)報告稱,在巴西以Bti防治埃及斑蚊、熱帶家蚊,LBIT 315、348、IB 604等品系之活性要比Bti以色列亞種強三倍之多。

  Melo-Santos等(2001)利用模擬生態體系,以Bti之緩慢釋散固體錠劑防治埃及斑蚊(Aedes aegypti)之四齡孑孓,曝露48小時後,幼蚊孑孓初死亡率(initial mortality)93-100﹪。生態體系曝露於陽光之下,殘效(孑孓70﹪死亡率)13-35天,但在陰涼遮陰處,殘效延長為40-54天。

  為了改良Bti,Manasherob等(2001)曾將Bti之基因植入大腸桿菌(Escherichia coli),但成效不彰。次年Manasherob等(2002)再以基因轉移技術將Bti及其delta內毒素蛋白基因轉植入氮固定纖毛藍菌Anabaena PCC 7120品系,可以防止日光紫外線之破壞。

  Dennett等(2000)嘗試以Bti添加黃豆油,施用於瘧蚊幼蟲之防治,冀利用黃豆油在水中懸浮性,增加Bti之防治效果,結果不但無增效作用,反而降低防治率。

  Wirth等(1997)稱Bti雖可取代化學殺蟲劑,選擇性的防治幼蚊孑孓,且為生物可降解之殺蟲劑(biodegradable insecticides),但彼以熱帶家蚊(Culex quinquefasciatus)篩選60代後,發現有抗藥現象,且Bti各品系間有交叉抗藥性產生。

蘇力菌2

蘇力菌


◆ 環境檢驗所 副所長 王正雄